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細(xì)菌的分離純化

添加時(shí)間：2017-03-16 點(diǎn)擊量：

劃線分離：制備果膠酶劃線培養(yǎng)基，滅菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌種，****次劃線分離培養(yǎng)1-2天后取分離所得單菌落再進(jìn)行第二次劃線分離，劃線分離的具體方法是：先在平皿上劃定區(qū)域，然后將接種針在火焰上進(jìn)行滅菌操作，取含菌種的培養(yǎng)皿，在火焰上方（注意：不能離火焰太近）打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋，先拿接種針在上蓋處劃線以降溫，然后用接種針輕挑所選菌落一到兩下，將平皿蓋上放好，再取剛剛冷卻了的干凈平皿在1區(qū)進(jìn)行劃線接種操作。操作完畢后對(duì)接種針進(jìn)行滅菌操作，完成后在火焰上方打開(kāi)平皿蓋，將接種針冷卻后從1區(qū)引線到2區(qū)，再如圖所示劃線，劃完后引線到3區(qū)，同上進(jìn)行劃線，劃線完畢后蓋蓋平放；

純種保藏：再配制一份普通細(xì)菌培養(yǎng)基，分裝試管后滅菌，制得斜面，將純種劃線接種在斜面上培養(yǎng)保存并進(jìn)行下一步的鑒定。

a) 純種果膠酶水解能力的測(cè)定

配制果膠酶篩選培養(yǎng)基，110度滅菌20-30分鐘，冷卻后倒平板在培養(yǎng)皿蓋周邊用記號(hào)筆做好標(biāo)記，將分離純化的細(xì)菌點(diǎn)種于平板上（注意：點(diǎn)種的量不宜過(guò)多，以3～4個(gè)為宜），在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，取培養(yǎng)后的平皿用0.5％的剛果紅染色15-20min后，倒掉剛果紅，用1mol/L的NaCl脫色幾分鐘至觀察到透明圈，測(cè)量并記錄透明圈的大小

b) 簡(jiǎn)單染色步驟

i. 涂片

取一塊載玻片，在上邊用膠頭滴管加半滴無(wú)菌水，用接種環(huán)無(wú)菌操作將沾有菌的接種環(huán)置于載玻片上的無(wú)菌水種涂抹，待看到微弱的渾濁即可；（注意取菌不要太多）

ii. 干燥與固定

涂菌面朝上，通過(guò)火焰以干燥并固定菌物，固定過(guò)程應(yīng)使載玻片通過(guò)火焰2-3次，注意溫度的控制，過(guò)熱的溫度會(huì)將細(xì)菌殺死，溫度以手背感覺(jué)微微發(fā)燙為標(biāo)準(zhǔn)；

iii. 染色

將載玻片平放于載波片支架上，滴加結(jié)晶紫染液覆蓋涂菌部位即可，染色1.5min

iv. 水洗

傾去染液，將載玻片的涂菌面朝下，自來(lái)水沖洗，水流不宜太急、太大，至洗出水無(wú)色為止；

v. 干燥

用吸水紙吸去多余水分后自然干燥；

vi. 鏡檢

將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)。

c) 革蘭氏染色步驟

i. 涂片

先在載玻片一側(cè)用記號(hào)筆標(biāo)記間隔的四個(gè)區(qū)域，在另一側(cè)四個(gè)區(qū)域的位置分別滴加半滴無(wú)菌水。分別取四種活躍生長(zhǎng)期菌種（大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，枯草桿菌和一種自選菌）按常規(guī)方法涂片（不宜過(guò)厚），用酒精燈按照簡(jiǎn)單染色中所述干燥和固定的方法對(duì)四種菌進(jìn)行干燥和固定。

ii. 初染

滴加草酸銨結(jié)晶紫染液使之覆蓋涂菌部位，染色1.5min后水洗；

iii. 媒染

先用盧戈氏碘液沖去殘留水跡，再用碘液覆蓋1min后水洗；

iv. 脫色

先用乙醇沖去水跡，然后用95%乙醇覆蓋脫去色素，脫色約30s，立即用水沖洗；

v. 復(fù)染

先用番紅洗去水跡，然后滴加番紅復(fù)染1.5min后水洗；

vi. 鏡檢

將制備好的樣片置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當(dāng)?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，用油鏡觀察細(xì)菌。分別以大腸桿菌與金黃色葡萄球菌所染顏色作為對(duì)照，來(lái)判斷枯草桿菌以及另一種自選菌的染色結(jié)果。

d) 芽孢染色步驟

i. 涂片，加熱干燥及固定

在潔凈蓋玻片接近中部?jī)商幏謩e滴一滴無(wú)菌水，分別接種枯草芽孢桿菌及梭狀芽孢桿菌。然后按照常規(guī)方法加熱干燥及固定；

ii. 孔雀綠加熱染色

用木夾夾住載玻片，向載玻片上滴加5%孔雀綠水溶液使之完全覆蓋涂菌部位，然后在酒精燈上微微加熱（孔雀綠著色能力強(qiáng)，加熱可使較難染色的芽孢染成綠色，且再難洗脫）至染液冒蒸汽開(kāi)始計(jì)時(shí)并維持5min，注意加熱時(shí)應(yīng)以有蒸汽微微冒出為宜，過(guò)熱或加熱不足均會(huì)影響觀察效果，且加熱時(shí)在載玻片上隨時(shí)補(bǔ)加染液，切勿讓涂片干涸；

iii. 水洗

水洗一定要等載玻片冷卻后進(jìn)行，否則可能導(dǎo)致載玻片的破裂。具體水洗按常規(guī)方法進(jìn)行；

iv. 復(fù)染

用0.5%番紅水溶液復(fù)染2min；

v. 水洗并干燥

按常規(guī)方法水洗后自然干燥；

vi. 鏡檢

先在低倍鏡下尋找視野范圍，然后換用高倍鏡調(diào)焦，最后加香柏油在油鏡下仔細(xì)尋找兩種細(xì)菌以及其周圍或內(nèi)部染成綠色的芽孢。

e) 半固體穿刺法觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性

i. 配制培養(yǎng)基

配制半固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，分裝于4支試管內(nèi)，110度滅菌20-30分鐘，正立于燒杯中冷卻至室溫；

ii. 在無(wú)菌操作臺(tái)上右手握接種針,以針挑取菌苔.垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)的中心直至接近(但勿觸及)試管底,然后循原路退出。如圖所示：